Untersuchung der Bioaktivität ungesättigter Oligo-Galacturonsäuren, die aus Apfelabfällen durch die Pektinasen Alcaligenes faecalis AGS3 und Paenibacillus polymyxa S4 hergestellt werden

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 15830 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Pektin ist einer der Hauptstrukturbestandteile in Früchten und ein unverdaulicher Ballaststoff aus D-Galacturonsäure-Einheiten mit α-(1-4)-Verknüpfung. Diese Studie untersucht den mikrobiellen Abbau von Pektin in Apfelabfällen und die Produktion bioaktiver Verbindungen. Zunächst wurden Pektin abbauende Bakterien isoliert und identifiziert, anschließend wurde die pektinolytische Aktivität mittels DNS bewertet. Die Produkte wurden mittels TLC und LC-MS-ESI bewertet. Die antioxidativen Wirkungen wurden mittels DPPH untersucht und die krebshemmenden Wirkungen sowie die Zytotoxizität wurden mittels MTT und Durchflusszytometrie analysiert. In dieser Studie wurden zwei neue Bakterienisolate, Alcaligenes faecalis AGS3 und Paenibacillus polymyxa S4, mit dem pektinolytischen Enzym eingeführt. Die Strukturanalyse zeigte, dass die Produkte des enzymatischen Abbaus ungesättigte Mono-, Di-, Tri- und Penta-Galacturonsäuren mit 74 % bzw. 69 % RSA bei 40 mg/ml für A. faecalis und P. polymyxa S4 umfassen. Die Ergebnisse der Antitumoreigenschaften von MCF-7-Zellen mittels MTT-Assay für Produkte von AGS3 und S4 bei 40 mg/ml nach 48 Stunden zeigten eine Überlebensrate von 7 % bzw. 9 %. Bei der durchflusszytometrischen Beurteilung waren die AGS3-Verbindungen bei 40 mg/ml innerhalb von 48 Stunden zu 100 % tödlich und führten beim S4-Isolat zu 98 % zum Tod. Die Zytotoxizitätsbewertung von L-929-Zellen ergab keine signifikante Toxizität für lebende Zellen.

Da die Bevölkerung der Erde wächst, war die Steigerung der Nahrungsmittelproduktion zur Deckung des Ernährungsbedarfs schon immer eines der Hauptanliegen der menschlichen Gesellschaften. Dieser Produktionsanstieg führt zusammen mit Faktoren wie der unkontrollierten Urbanisierung und dem Fehlen geeigneter Abfallbewirtschaftungs- und Recyclingmethoden zur Anhäufung von Abfällen in der Umwelt, was zu irreversiblen Umweltschäden führt1. Nach Angaben der Ernährungs- und Landwirtschaftsorganisation der Vereinten Nationen (FAO) beträgt die Obst- und Gemüseproduktion weltweit mehr als 1,74 Milliarden Tonnen, wovon 10–50 Prozent in verschiedenen Ländern verschwendet werden. Der Wert der weltweiten Lebensmittelverschwendung wird auf 1 Billion US-Dollar pro Jahr geschätzt. Die für die Produktion dieser Menge verschwendeter Lebensmittel verwendeten Ressourcen sind für den Ausstoß von 4,4 Gigatonnen Treibhausgasen (entspricht CO2) pro Jahr verantwortlich, was verschwendete Lebensmittel nach China und den Vereinigten Staaten zum drittgrößten Treibhausgasproduzenten der Welt macht2.

Das Ausmaß der Lebensmittelverluste variiert in den verschiedenen Phasen der Produktionskette, abhängig von der Art des Produkts, dem wirtschaftlichen Entwicklungsstand und den sozialen und kulturellen Bedingungen in einem geografischen Gebiet. Bei Obst und Gemüse ist der FAO-Studie zufolge in Industriegebieten die Verschwendung bei der Ernte, Sortierung und Sortierung vorherrschend. Während in Entwicklungsgebieten der Lebensmittelverlust während der Ernte-, Sortier- und Sortierphase hoch ist, ist die Menge an Verschwendung während der Verarbeitungsphase (14–21 %) viel höher als in entwickelten Gebieten (weniger als 2 %)2,3. Dabei werden die meisten Obstprodukte vor dem Verzehr verarbeitet, wodurch nicht nur der Wert erhöht wird, sondern auch die Qualität und Anzahl der auf dem Markt erhältlichen Früchte erhalten bleibt4. Bei der Verarbeitung fallen große Abfallmengen an, was hohe Kosten für Behandlungen zur Reduzierung der Umweltbelastung mit sich bringt5,6. Somit stellen Abfälle aus der Obstverarbeitung nicht nur erhebliche Mengen an Lebensmittelabfällen dar, was schwere Umweltschäden bedeutet, sondern auch auf den Verlust hochwertiger Nährstoffe hinweist7. Daher ist die Umwandlung von Abfällen in Mehrwertprodukte wichtig und notwendig, um die Nachhaltigkeit und Effizienz der Lebensmittelversorgungskette zu verbessern8.

Im Laufe der Jahre wurde in zahlreichen Studien die Herstellung von Mehrwertprodukten durch mikrobielle Umwandlung oder enzymatische Prozesse von Fruchtabfällen wie Enzymen, Bioethanol, organischen Säuren, Heteropolysacchariden, aromatischen Verbindungen, mit Proteinen angereicherten Futtermitteln, präbiotischen Oligosacchariden und bioaktiven Verbindungen untersucht , wurde untersucht9. Die mikrobielle Verarbeitung restlicher Fruchtfasern ist ein relativ neuer Ansatz, bei dem Abfälle als Monomere für die Synthese natürlicher nützlicher Oligomere verwendet werden10.

Im Allgemeinen besteht die Struktur der Frucht aus verschiedenen Verbindungen mit unterschiedlichen Eigenschaften. Nach Wasser kommt es am häufigsten vor Kohlenhydraten, die in den meisten Früchten 50 bis 80 % des Trockengewichts ausmachen11. Bei vielen Kohlenhydraten in Obstabfällen handelt es sich um Ballaststoffe, wobei Pektin bis zu 40 % der Verbindungen ausmacht12. Pektine sind eine Familie saurer Polysaccharide mit hohem Molekulargewicht, die in der primären Zellwand von Pflanzen reichlich vorhanden sind und hauptsächlich aus D-Galacturonsäureeinheiten in der Hauptkette mit α (1-4)-Verknüpfung sowie geringen Mengen Rhamnose in der Hauptkette bestehen Hauptkette und Arabinose, Galactose und Xylose in den Seitenketten10,13. Mehrere Studien haben die Anwendungsmöglichkeiten von Pektin in der Lebensmittel- und Pharmaindustrie aufgezeigt. Studien deuten darauf hin, dass kurzkettige Pektine weitreichendere Anwendungsmöglichkeiten haben, etwa als Präbiotikum, als Antikrebsmittel, als Medikamentenverabreichungssysteme, als Radikalfänger, zur Senkung des Cholesterinspiegels usw., und diese Eigenschaften hängen mit der Struktur und dem Molekulargewicht von Pektinverbindungen zusammen10 ,14.

Radikale Arten werden mit chronisch obstruktiver Lungenerkrankung (COPD), Asthma, Diabetes, Entzündungen, Herz-Kreislauf-Erkrankungen und Myokardinfarkt in Verbindung gebracht. Als Ursache der Zytotoxizität gelten synthetische Antioxidantien, die üblicherweise in Herstellungsprozessen eingesetzt werden. Andererseits gelten natürliche Polysaccharide als zuverlässige Antioxidantien, die freie Radikale abfangen und gesundheitsschädliche synthetische Substanzen überwinden können. Die Verbindungen, die reich an Rhamnogalacturonan I sind, sowie die Verbindungen, die aus Homogalacturonan in der Hauptkette und Rhamnogalacturonan I und Arabinogalactan in den Seitenketten bestehen, weisen die höchsten antioxidativen Eigenschaften auf; Daher können die antioxidativen Eigenschaften von Pektinverbindungen auf die Struktur von Rhamnogalacturonan I, Homogalacturonan und Arabinogalactan zurückgeführt werden15. Aus Pektin gewonnene Oligogalacturonsäuren, die durch verschiedene Behandlungen modifiziert wurden, können auch Verbindungen wie anionische Superoxide, Hydroxyl- und reaktive Sauerstoffspezies reinigen. Sie erhöhen auch die antioxidativen Eigenschaften von Enzymen: Superoxiddismutase, Katalase und Glutathionperoxidase und zeigen antioxidative Eigenschaften, indem sie die Menge an Glutathion erhöhen16.

Eine weitere vielversprechende biologische Aktivität von Pektin ist seine potenzielle Rolle bei der Vorbeugung und Reduzierung der Krebsentstehung. Die positiven Wirkungen von „modifiziertem Pektin“, sei es in Form von kommerziellen Produkten wie modifiziertem Zitruspektin (z. B. GCS-100, FPP oder Pectasol) oder im Labor modifiziertem Pektin, wurden untersucht und nachgewiesen. Insbesondere Citrus-modifiziertes Pektin (MCP) wurde und wird intensiv erforscht17. Nicht alle MCPs sind gleich, da der Begriff zur Beschreibung wasserlöslicher Polysaccharide verwendet wird, die aus Pektin gewonnen werden, das aus Zitrusschalen und Fruchtfleisch hergestellt wird, das bei hoher Temperatur, hohem pH-Wert oder enzymatischer Zersetzung behandelt wurde. pH-modifiziertes Zitruspektin hat ein reduziertes Molekulargewicht, wird aus kommerziellem Zitruspektin gewonnen und verfügt über galaktosereiche Seitenketten, die an das prometastatische Protein Galactin-3 binden und die Metastasierung von Tumorzellen hemmen können. Galactin-3 spielt eine Schlüsselrolle bei mehreren intrazellulären physiologischen und pathologischen Prozessen, einschließlich der Tumorzellproliferation und Apoptose. Die Bindung von MCP an Galactin-3 kann die negativen Auswirkungen von Galactin-3 hemmen, beispielsweise die Hemmung seiner Fähigkeit, die Adhäsion und Migration von Tumorzellen zu fördern und Apoptose zu verhindern. Zusätzlich zu den galaktosereichen Seitenketten hat der Homogalacturonan-Anteil von Pektin auch eine krebshemmende Wirkung. Pektinfragmente mit niedrigem Molekulargewicht (1 kDa), die reich an Galacturonsäure sind, wurden von Krebszellen von Mäusen und Menschen absorbiert, was das Wachstum dieser Zellen hemmte und zur Freisetzung von Laktatdehydrogenase und Galactin-3 aus ihnen führte. Zusätzlich zur Wechselwirkung mit Galactin-3 wurden einige andere potenzielle krebshemmende Wirkungen modifizierter Pektine sowohl unter In-vitro- als auch unter In-vivo-Bedingungen berichtet18. Fraktioniertes Zitruspektinpulver (FPP) mit niedrigem Molekulargewicht, das durch Hydrolyse im Autoklaven oder eine Kombination aus Erhitzen und enzymatischer Hydrolyse hergestellt wird, induziert auch die Apoptose von Androgenen und androgenunabhängigen Prostatakrebszellen. MCPs, die durch den enzymatischen Abbau von Pectasol hergestellt werden, induzierten Apoptose in Prostatakrebszellen und verlängerten die Verdopplungszeit des prostataspezifischen Antigens (PSA) bei Patienten, die sich verschiedenen Behandlungen zur Behandlung von Prostatakrebs unterzogen. Es wurde auch gezeigt, dass enzymatisch hydrolysiertes Zitruspektin klinische Vorteile, eine verbesserte Lebensqualität und eine Schmerzlinderung bei Patienten mit fortgeschrittenen Tumoren verschiedener Krebsarten hat19.

Pektine können durch verschiedene Abbaumethoden wie enzymatische Hydrolyse, Säurehydrolyse, hydrothermale Verarbeitung, Hochdruck-Mikrofluidisierung oder photochemische Reaktion in TiO2-haltigem Medium zu Pektin-Oligosacchariden (POS) abgebaut werden10,20. Enzymatische Methoden haben erhebliche Vorteile gegenüber anderen Methoden, wie zum Beispiel: (1) die Reaktion wird unter milden Betriebsbedingungen durchgeführt, (2) das Hydrolysemedium verursacht keine Korrosion, (3) es werden keine giftigen oder kontaminierenden Chemikalien verwendet (4) die Hydrolyse erfolgt selektiv und betrifft nur bestimmte konstituierende Einheiten oder Bindungen, wie es für eine enzymkatalysierte Reaktion erwartet wird; (5) die Reaktionseffizienz kann höher sein als mit chemischen Methoden erreichbar und (6) die Bildung unerwünschter Produkte wird vermieden21. Pektinolytische Enzyme werden in zwei Hauptgruppen eingeteilt: (a) Esterasen, einschließlich Pektinmethylesterase, und (b) Depolymerasen, einschließlich Hydrolase und Lyase22. Viele Pilzarten können Pektin abbauen, indem sie verschiedene pektinolytische Enzyme produzieren. Studien haben gezeigt, dass Alternaria sesami pektinolytische Enzyme produziert, darunter Polygalacturonase-Transeliminasen, Pektin-Transeliminasen und Polygalacturonasen23. Elrod berichtete erstmals, dass das Erwinia-Bakterium Pektin abbauen konnte23. Zucker et al.24 und Chatterjee et al.25 zeigten die Produktion von induzierter und extrazellulärer Endopolygalacturonase durch Pseudomonas fluorescens und Erwinia.

Als Mitglied der Alcaligenaceae aus der Klasse der Betaproteobakterien findet Alcaligenes faecalis zahlreiche Anwendungen in der Biotechnologie sowie in der Lebensmittel- und Gesundheitsindustrie. Alcaligenes spp. wurde bei der Herstellung von kunststoffähnlichem Speichermaterial, Enzymen, Polysacchariden und auch bei der kommerziellen Produktion von Aminosäuren als Lebensmittelzusatzstoffe verwendet26.

Als Mitglied der Paenibacillaceae aus der Bacilli-Klasse ist Paenibacillus polymyxa an einer Vielzahl physiologischer und biotechnologischer Prozesse beteiligt. Verschiedene Stämme dieser Bakterien können zur Stickstofffixierung, Antibiotikaproduktion und Phosphorlösung im Boden verwendet werden. Es ist bekannt, dass P. polymyxa über hydrolytische Wege zellwandabbauende Enzyme produziert. Es wurde berichtet, dass verschiedene Stämme von P. polymyxa Exopolysaccharide (EPS) produzieren, die als sekundärer Metabolit ein breites Anwendungsspektrum in der Bioindustrie haben27.

In der aktuellen Studie wurden A. faecalis, AGS3 und P. polymyxa S4 isoliert und identifiziert. Ziel dieser Studie war es, den mikrobiellen Abbau von Pektin durch Pektinase der isolierten Bakterienisolate A. faecalis AGS3 und P. polymyxa S4 zu untersuchen und erstmals Produkte zu identifizieren und anschließend die krebshemmenden und antioxidativen Eigenschaften der erhaltenen Verbindungen zu untersuchen.

Isoliert AGS3, gramnegativ, nicht säurefest, aerob, stäbchenförmig, Katalase-positiv, Oxidase-positiv, Citrat-positiv und beweglich und S4 grampositiv, nicht säurefest, aerob, stäbchenförmig, Katalase-negativ, Oxidase-negativ, Citrat-negativ und nicht beweglich (Abb. 1b) wurden anhand ihres klaren Halo-Bereichsradius ausgewählt (Abb. 1a). Optimale Wachstumsbedingungen für beide Isolate waren 30 °C und pH 6,8–7,0. Die Ergebnisse der phylogenetischen Analyse, die mit der Maximum-Likelihood-Methode durchgeführt wurde, zeigten, dass das Isolat AGS3 zur Proteobacteria phylum, der Familie der Alcaligenaceae und der Gattung Alcaligenes gehört und S4 ein Mitglied der Firmicutes phylum, der Familie der Paenibacillaceae und der Gattung der Paenibacillus war (Abb. 1c). Darüber hinaus ergab die BLAST-Analyse, dass die AGS3- und S4-Isolate zur Art Alcaligenes faecalis bzw. Paenibacillus polymyxa gehörten. Von nun an wurde die Sequenz der Isolate A. faecalis AGS3 (MZ093052) und P. polymyxa S4 (MZ596260) an GenBank, das National Center for Biotechnology Information (NCBI), übermittelt.

(a) Halo-Bereich um ausgewählte Bakterienisolate AGS3 und S4, der pektinolytische Aktivität durch Abbau von Polygalacturonsäure zeigt (gelbe Halo-Bereiche). (b) Mikroskopisches Bild von AGS3- und S4-Bakterienisolaten. (c) Phylogenetische Beziehungen des A. faecalis-Isolats AGS3 und des P. polymyxa-Isolats S4. Der Baum wurde mit der MEGA 11-Software unter Verwendung der Maximum-Likelihood-Methode mit 1000 Bootstraps erstellt.

Alcaligenes faecalis ist vor allem für die anaerobe Atmung mit Nitrit und den Abbau mikrobieller Reservepolymere wie Poly-(3-hydroxybutyrat) (PHB) bekannt. A. faecalis wurde auch bei der Produktion nicht standardmäßiger Aminosäuren verwendet. Obwohl bekannt ist, dass A. faecalis über eine Vielzahl hydrolytischer Enzyme verfügt, die beim biologischen Abbau von Pflanzenabfällen eingesetzt werden können, bedarf die Untersuchung ihres Potenzials weiterer Fortschritte26.

Paenibacillus polymyxa ist dafür bekannt, eine Vielzahl sekundärer Metaboliten zu produzieren, die es ihm ermöglichen, verschiedenen Umweltbelastungen zu widerstehen und es zu einem vielversprechenden biotechnologischen Wirkstoff in der Landwirtschaft und in industriellen Prozessen zu machen. P. polymyxa verfügt über die Fähigkeit zur Stickstofffixierung sowie über die Produktion von pflanzenwachstumsregulierenden Faktoren, hydrolytischen Enzymen und antibiotischen Verbindungen. P. polymyxa-Stämme sind dafür bekannt, mehrere hydrolytische Enzyme zu produzieren, darunter Proteasen, β-1,3-Glucanasen, Cellulasen, Xylanase, Lipase, Amylase, Chitinasen und Pektinase. Daher wurde in verschiedenen Studien die Leistungsfähigkeit von P. polymyxa-Stämmen bei der Abfallbewirtschaftung und Abwasseraufbereitung untersucht. Verbindungen, die durch die hydrolytische Aktivität von P. polymyxa-Enzymen entstehen, wurden jedoch noch nicht identifiziert und bedürfen weiterer Untersuchungen27.

Der Pektinabbautest wurde unter Verwendung von DNS-Reagenz durchgeführt, um die Anzahl der Pektinoligosaccharide (POS) zu bestimmen, die durch die Pektinaseaktivität von A. faecalis AGS3- und P. polymyxa S4-Isolaten produziert wurden. Die Ergebnisse der Bestimmung der höchsten Ausbeute an POS-Freisetzung zeigten, dass die Isolate A. faecalis AGS3 (Abb. 2a) und P. polymyxa S4 (Abb. 2b) ihre maximale Konzentration an freigesetzten Zuckern nach 20-stündiger und 4-stündiger Inkubation bei 30 °C aufweisen C, jeweils 180 U/min.

Überwachung der Menge an Pektin-Oligosaccharid, die aus (a) A. faecalis AGS3-Isolat und (b) P. polymyxa S4-Isolat freigesetzt wird, in Pektin-Kulturmedium – 30 °C 180 U/min.

Am Ende wurden die erhaltenen POSs lyophilisiert und zur weiteren Analyse aufbewahrt.

Zur Überprüfung des Pektinabbaus durch die Isolate wurde eine Dünnschichtchromatographie (TLC) durchgeführt. TLC-Muster bestätigten den Abbau von Pektin zu POS in beiden Isolaten (Abb. 3a). Die weitere Analyse der produzierten Oligogalacturonsäuren wurde mittels LC-ESI-MS lyophilisierter Proben durchgeführt. Die LC-ESI-MS-Massenspektren der Produktfraktionen der Isolate A. faecalis AGS3 und P. polymyxa S4 zeigten, dass in beiden Isolaten unterschiedliche Arten von Oligogalacturonsäuren in den enzymatischen Produkten des Pektinabbaus vorhanden waren (Abb. 3b, c, Tabelle 1). ). Am Ende wurden Formen von Monogalacturonsäure und ungesättigter Mono-, Di-, Tri- und Pentagalacturonsäure identifiziert. Es gibt verschiedene Arten von pektinolytischen Enzymen. Bei der durch Pektinlyase durchgeführten Reaktion entstehen ungesättigte Oligogalacturonate. Daher wird bei Berücksichtigung der in dieser Studie erhaltenen Produkte davon ausgegangen, dass die pektinolytische Aktivität der Isolate A. faecalis AGS3 und P. polymyxa S4 auf das Enzym Pektinlyase zurückzuführen ist.

(a) TLC-Bewertungsmuster von Proben, die aus der pektinolytischen Aktivität von Isolaten gewonnen wurden, S1: Standardlösung von Glucose, S2: Pektin-Oligosaccharid, erhalten aus A. faecalis AGS3, S3: Pektin-Oligosaccharid, erhalten aus P. polymyxa S4, S4: Standardlösung von Monogalacturonsäure; LC-ESI-MS-Massenspektren von Proben, die aus dem Pektinabbau durch (b) A. faecalis AGS3 und (c) P. polymyxa S4 gewonnen wurden.

Im Allgemeinen gehören die meisten bekannten Pektinasen zu Pilzen wie Aspergillus, Alternaria und Penicillium28,29,30,31. Dennoch gibt es Berichte, die verschiedene Arten von pektinolytischen Enzymen in den Bakterien belegen; Beispielsweise wurde berichtet, dass Acinetobacter guillouiae, Kosakonia sacchari und Bacillus vallismortis Polygalacturonasen aufweisen. Pektin- und Pektatlyasen sind nachweislich in Streptomyces-, Actinomycetes-, Pseudomonas- und Bacillus-Arten vorhanden31,32. Es gibt einige endophytische Krankheitserreger wie Xanthomonas compestris, Ervinia chrysanthemi, Colletotrichum lindemuthianum, Pseudomonas siringea und Phytophthora capsici, von denen berichtet wird, dass sie eine pektinolytische Aktivität haben31. Studien deuten darauf hin, dass einige Darmpathogene, darunter Salmonellen und Escherichia coli, trotz ihres Mangels an pektinolytischen Enzymen in der Lage sind, Oligomere zu verwerten, die beim Pektinabbau entstehen10,31. Wir glauben, dass diese Studie die erste ist, die Verbindungen identifiziert, die aus der pektinolytischen Aktivität von A. faecalis und P. polymyxa stammen.

Die Radikalfängeraktivität (RSA) der erhaltenen POS wurde mit dem DPPH-Reagenz getestet. Die Ergebnisse für einen Konzentrationsbereich von 1,25 bis 80 mg/ml zeigten, dass die antioxidative Wirkung von POS durch Erhöhung ihrer Konzentration zunimmt. Der RSA von POS, der aus dem AGS3-Isolat von A. faecalis gewonnen wurde, lag zwischen 18 und 81 % für Konzentrationen von 1,25 bis 80 mg/ml, und die Ergebnisse für P. polymyxa zeigten einen RSA-Bereich von 13 bis 74 % für die gleichen Konzentrationen (Abb. 4). ).

Bewertung der antioxidativen Eigenschaften von Oligosacchariden, die durch den Pektinabbau durch DPPH-Reagenz gewonnen werden.

Oxidativer Stress ist ein Konzept, das mit dem Verlust des Gleichgewichts zwischen Prooxidantien und Antioxidantien verbunden ist und mit der Physiologie häufiger Krankheiten zusammenhängt. Antioxidantien haben die Aufgabe, reaktive Formen von Sauerstoff zu neutralisieren, die sich negativ auf lebende Zellen auswirken33. Yeung et al.34 nutzten die Fenton-Reaktion zur Hydrolyse von Okra-Pektin und stellten fest, dass die antioxidative Aktivität des gewonnenen POS konzentrationsabhängig ist. Die Ergebnisse des DPPH-Assays von POS, das durch enzymatische Hydrolyse der Streptomyces-Hydrogenasen YAM1 gewonnen wurde, zeigten, dass RSA in höheren Konzentrationen zunimmt. Hosseini Abari et al.10 zeigten außerdem, dass enzymatisch modifiziertes Pektin im Vergleich zu unbehandelten Pektinpolysacchariden eine stärkere antioxidative Aktivität aufweist. Ähnliche Studien bestätigen die Dosisabhängigkeit der antioxidativen Aktivität von POS. In dieser Studie wurde, wie in Abb. 6 gezeigt, hinsichtlich der Zunahme der antioxidativen Eigenschaften von Proben nach Konzentration der höchste RSA bei 80 mg/ml der Proben aus A. faecalis AGS3 und P. polymyxa S4 gemeldet. Bei 20 mg/ml POS betrugen die Ergebnisse 59 % für P. polymyxa S4 und 69 % für A. faecalis AGS3, was einen Anstieg der RSA um 20–30 % im Vergleich zu Polygalacturonsäuren zeigte, wie in Hosseini Abari et al. erwähnt. studieren10. Diese Ergebnisse zeigen einen signifikanten Anstieg des RSA von POS im Vergleich zu den Ergebnissen der antioxidativen Aktivität von Pektinpolysacchariden aus früheren Studien. Dies ist der erste Bericht über RSA in Produkten der Arten A. faecalis und P. polymyxa.

Eine mittels MTT-Assay und Durchflusszytometrie durchgeführte Bewertung zeigte eine signifikante Antikrebsaktivität auf MCF-7-Zellen für POS, das aus Apfelabfällen unter Verwendung pektinolytischer Enzyme von P. polymyxa S4- und A. faecalis AGS3-Isolaten gewonnen wurde. Wie in Abb. 5 erwähnt, zeigten die Ergebnisse des MTT-Assays eine maximale Verringerung der Lebensfähigkeit der Zellen bei 40 mg/ml POSs aus A. faecalis AGS3 und P. polymyxa S4 mit 93 % bzw. 91 % nach 48-stündiger Inkubation. Eine minimale Verringerung der Lebensfähigkeit der Zellen wurde bei 1,25 mg/ml POS nach 24-stündiger Behandlung mit 17 % bzw. 37 % für A. faecalis AGS3 und P. polymyxa S4 erreicht.

MTT-Bewertung von MCF-7-Zellen nach einer Behandlung von (a) 24 Stunden und (b) 48 Stunden.

Ebenso zeigten die Ergebnisse der durchflusszytometrischen Analyse bei 5 und 40 mg/ml der erhaltenen POSs nach 48-stündiger Inkubation eine Induktion von Apoptose, mit 84 % und 100 % für A. faecalis AGS3 und 90 % und 98 % für P. polymyxa S4 ( Abb. 6b). In Abb. 6b stellt die Zone M1 die Verteilung lebender Zellen dar, die nicht mit dem PI-Reagenz gefärbt wurden, und die Zone M2 zeigt tote Zellen, die mit dem PI-Reagenz gefärbt wurden. Wie in Abb. 6a zu sehen ist, unterlagen die behandelten Zellen auch morphologischen Veränderungen.

Die Ergebnisse der Zelllebensfähigkeit von MCF-7 nach 48-stündiger Behandlung mit 5 und 40 mg/ml POS wurden von A. faecalis AGS3 und P. polymyxa S4 erhalten, wobei (a) morphologische Aspekte behandelter Zellen im Vergleich zu Kontrollzellen (unbehandelt) zeigt und (b) zeigt die durchflusszytometrische Analyse behandelter Zellen im Vergleich zu Kontrollzellen (unbehandelt).

Krebs ist eines der bedeutendsten Gesundheitsprobleme der Welt und weist zahlreiche physiologische und biochemische Auslöser auf, die als Karzinogene bezeichnet werden. Die meisten synthetischen Arzneimittel, die in chemotropen Behandlungen eingesetzt werden, können aufgrund ihrer Nebenwirkungen auf nicht krebsartige Zellen und der Entstehung einer Arzneimittelresistenz bei krebsartigen Zellen zu größeren Problemen für Patienten führen. Daher ist die Verwendung natürlicher Verbindungen mit hohen krebshemmenden Eigenschaften eine überlegene Lösung geworden10,13,35 . Studien haben gezeigt, dass enzymatisch hydrolysierte Zitruspektinfragmente das Fortschreiten des proliferativen Prostatakrebses beeinflussen können, indem sie den Serum-PSA nach 14-monatiger Behandlung um 50 % senken. Es wurde nachgewiesen, dass enzymatisch behandelte Zitrus- und Apfelpektine das Wachstum hemmen und Apoptose in menschlichen Darmkrebszellen auslösen können19. Modifiziertes Apfelpektin mit niedrigem Molekulargewicht hemmt den Zellzyklus in Darmtumoren in menschlichen Darmkrebszellen (HT-29) in vitro und bei Colitis-assoziiertem Darmkrebs bei Mäusen36. Das gleiche Apfelpektin mit niedrigem Molekulargewicht reduzierte das Risiko von Darmkrebstumoren bei Mäusen und es wurde berichtet, dass es an Galactin-318 bindet. Die Untersuchung der Monosaccharidzusammensetzung ergab, dass Galacturonsäure der Hauptbestandteil der modifizierten Pektinstruktur war und nur geringe Mengen Galactose darin gefunden wurden. Die Monosaccharidzusammensetzung ähnelt jedoch der von Pectasolmonosacchariden. Obwohl MCP möglicherweise nicht reich an Galactooligo-Sacchariden ist, kann es im Vergleich zu Oligo-Galacturonsäuren selektiv im Dünndarm absorbiert werden37. In der Studie von Delphi et al. Bei MDA-MB-231-Krebszellen induzierte die Behandlung mit POS Apoptose und verringerte das Überleben von Krebszellen38. Die Ergebnisse der Messung der Wirkung von Pektin-Oligosacchariden und Pektin-Polysacchariden auf die Krebszelllinie HT29 durch Li et al.39 zeigten, dass POSs bei der Hemmung von Krebszellen in viel geringeren Konzentrationen wirksamer sind als Pektin. Hosseini Abari et al.10 zeigten eine Apoptose der MCF-7-Zelllinie von 92 % nach 24-stündiger Behandlung mit 20 mg/ml POS, was deutlich höher war als die Wirkung von Pektin in derselben Konzentration. Zur Unterstützung früherer Ergebnisse erhielt unsere Studie Oligosaccharide, die sowohl für P. polymyxa S4- als auch für A. faecalis AGS3-Proben signifikante Antikrebseigenschaften zeigten. Nach unserem besten Wissen gibt es keine früheren Berichte über Antitumoreigenschaften für Produkte der Arten P. polymyxa und A. faecalis.

Die zytotoxischen Auswirkungen der erhaltenen POSs auf L-929-Zellen wurden nach 48-stündiger Inkubation mittels MTT-Assay bestimmt. L-929-Zellen wurden mit 5 und 40 mg/ml der erhaltenen Produkte behandelt und unbehandelte Zellen wurden als Kontrolle verwendet. Wie in Abb. 7a erwähnt, zeigte die Analyse keine signifikante Toxizität für A. faecalis AGS3 mit weniger als 3 % Todesfällen und für P. polymyxa S4 mit etwa 2 % Todesfällen. Die in Abb. 7b gezeigte Morphologie der behandelten Zellen bestätigte die Ergebnisse des MTT-Assays.

Zytotoxizitätsbewertung der erhaltenen POSs auf L-929-Zellen nach 48-stündiger Inkubation. (a) Die Ergebnisse des MTT-Tests der behandelten Zellen zeigten im Vergleich zur Kontrolle keine signifikante Zytotoxizität. (b) Die mikroskopische Analyse der behandelten Zellen zeigte keine Veränderung der Morphologie der Zellen im Vergleich zur Kontrolle.

Die Zytotoxizität von Medikamenten, die zur Behandlung von Krebs an nicht krebsartigen Zellen eingesetzt werden, ist ein großes Problem bei chemotropen Behandlungen. Im Gegensatz zu früheren Ergebnissen von Delphi et al. die Toxizität bei hohen POS-Konzentrationen auf HUVEC-Zellen zeigten, wurde in der aktuellen Studie nach 48-stündiger Behandlung von L-929-Zellen mit 40 mg/ml POSs keine signifikante Toxizität beobachtet38. Nach unseren Informationen untersuchte keine andere Studie die Zytotoxizität von POS, das aus A. faecalis und P. polymyxa gewonnen wurde.

Als Ergebnis dieser Studie wurden zwei neue Bakterienisolate, Alcaligenes faecalis AGS3 und Paenibacillus polymyxa S4, isoliert und identifiziert. Die genannten Isolate waren in der Lage, Pektin zu einer Reihe ungesättigter Pektin-Oligosaccharide abzubauen. In dieser Studie wurde zum ersten Mal die Bioaktivität der pektinolytischen Aktivität von Verbindungen untersucht, die aus den Arten A. faecalis und P. polymyxa gewonnen wurden. Die Ergebnisse zeigten deutlich höhere antioxidative und krebshemmende Eigenschaften, obwohl sie für lebende Zellen ungiftig sind. Die hervorragende Bioaktivität der gewonnenen Verbindungen sowie die Fähigkeit, Fruchtabfälle aus der Umwelt zu entfernen, machen sie zu einer großartigen wirtschaftlichen und ökologischen Lösung für ein wachsendes Problem in der Welt.

In dieser Studie wurden Abfälle der Apfelsorte Golden Delicious (Malus Domestica) verwendet. Der erwähnte Abfall wurde auf dem örtlichen Obstmarkt des Obstladens Bahar, Isfahan, Provinz Isfahan, Iran, gekauft. Die Äpfel wurden geschält und in 3 mm große Würfel geschnitten. Anschließend wurden 30 g des gehackten Apfelabfalls zu einer Lösung bestehend aus Zitronensaft (12,5 ml), Zitronensäure (0,1 g) und 150 ml destilliertem Wasser gegeben. Die Mischung wurde 30 Minuten lang auf der Heizung gekocht und dann durch ein Baumwolltuch filtriert. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wurden 30 ml 96 %iger Ethylalkohol zur filtrierten Lösung gegeben und dann eine Stunde lang bei 4 °C gehalten, um eine gelierende Form zu erreichen. Der Überstand der Mischung wurde nach 10-minütiger Zentrifugation bei 800 g verworfen. Am Ende wurde das Sediment, das das extrahierte Pektin enthielt, gefriergetrocknet40.

Als Isolationsquelle wurden Bodenproben aus 12 verschiedenen Gebieten entnommen. Die Proben wurden gelöst und eine Stunde lang in Ringer-Lösung gut gemischt und dann in Nähragarmedium mit 0,25 ml 1 % Clotrimazol in 100 ml destilliertem Wasser kultiviert. Ausgewählte Isolate wurden dann in Pektin-Agar-Medium kultiviert, das extrahiertes Pektin (0,5 g), Hefeextrakt (0,1 g), Pepton aus Kasein (0,5 g), CaCl2 (0,2 g), NaCl (0,2 g) und Agar (1,5 g) enthielt. in 100 ml destilliertem Wasser41. Nach 24 Stunden bei 30 °C wurden Pektin abbauende Kolonien durch Messung ihrer klaren Halofläche als Ergebnis der Zugabe von 1 % I/KI-Reagenzlösung zu den Platten differenziert42. Die Isolate AGS3 aus Gartenerde und S4 aus Walderde wurden ausgewählt und identifiziert. Die universellen Primerpaare 27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′) und 1492R (5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′) wurden als Vorwärts- bzw. Rückwärtsprimer zur Amplifikation des 16S-rRNA-Gens verwendet und anschließend wurde das Sequenzierungsverfahren von Bio Magic Gene durchgeführt (BMG) Unternehmen, China. Die Sequenzen wurden an GenBank und NCBI übermittelt und die evolutionäre Verwandtschaftsgeschichte wurde mithilfe der Maximum-Likelihood-Tree-Methode in der MEGA 11-Software untersucht. Als Fremdgruppe wurde die 16S-rDNA-Sequenz des Streptomyces maltophilia-Stammes YS4 verwendet (MT071635.1).

Der Pektinabbau wurde mithilfe der quantitativen Analyse reduzierender Zucker durch 3,5-Dinitrosalicylsäure (DNS-Methode) bestimmt. Nach der Beimpfung von Bakterienisolaten in das Pektinbrühemedium, das extrahiertes Pektin (0,5 g), Hefeextrakt (0,1 g), Pepton aus Kasein (0,5 g), CaCl2 (0,2 g) und NaCl (0,2 g) in 100 ml destilliertem Wasser enthält Alle zwei Stunden wurden 4 ml Bakterienmedium unter sterilen Bedingungen extrahiert. Anschließend wurde die Bakterienmasse durch 5-minütiges Zentrifugieren bei 2400 g vom Medium abgetrennt. 1 ml DNS-Reagenz wurde in ein Röhrchen mit Schraubverschluss gegeben, das den Kulturüberstand enthielt, und die Reaktionsröhrchen wurden 5 Minuten lang gekocht und auf Raumtemperatur abgekühlt. 1 ml 0,5 %iges Natriumsulfat wurde in die Reagenzgläser gegeben, um eine stabile Farbe zu erhalten, und die Absorptionswerte wurden bei 540 nm43 abgelesen.

Zur Detektion von Pektinabbauprodukten wurde Dünnschichtchromatographie (TLC) eingesetzt. 1,5 μl der Kulturüberstände als Probe, 1 mM Lösung von Monogalacturonsäuren und eine 1 mM Glucoselösung als Standardlösungen (gekauft von Sigma) wurden auf Kieselgel 60 F254 (Merck) getüpfelt. Die Chromatographie wurde dreimal in n-Butanol/Essigsäure/Wasser (2:1:2) als mobile Phase durchgeführt. Die Visualisierung der getrockneten Flecken auf Kieselgel erfolgte durch Aufsprühen von Orcinol/Schwefelsäure-Reagenz (8 mg Orcinol in 10 ml 70 %iger Schwefelsäure). Anschließend wurden die Platten 10 Minuten lang auf 100 °C erhitzt32.

Die erhaltenen Pektinabbauprodukte wurden mittels LC-ESI-MS analysiert und identifiziert. 2 mg jeder Probe wurden in 100 μl destilliertem Wasser gelöst und der lösliche Anteil der Proben untersucht. Die Untersuchung wurde isokratisch mit einer Mischung aus Wasser und Acetonitril (90:30) als mobiler Phase durchgeführt und die Flussrate wurde auf 0,3 ml/min eingestellt. Dazu wurde ein LC-System der Agilent 1100-Serie verwendet, das aus einer quaternären Förderpumpe, einem thermostatisierten Säulenfach, einem Entgaser (Agilent Technologies, Deutschland) und einem manuellen Injektorventil Rheodyne 7725i mit einer 20-µL-Probenschleife (Cotati, CA, USA) besteht Bereiten Sie eine Probe vor und die Massenspektrometrie wurde mit dem Agilent 6410 Triple Quadrupol-Massenspektrometer (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA) durchgeführt, das von der Agilent MassHunter Workstation B.01.03 betrieben wurde. Die Ionisierung wurde durch Elektrospray-Ionisation (ESI) im negativen Modus mit einer Kapillarspannung von 4000 V erreicht. Als Zerstäubergas wurde Stickstoff mit einem Zerstäuberdruck von 40 psi und einer Quellentemperatur von 100 °C verwendet. Stickstoff wurde auf 300 °C erhitzt und mit einer Durchflussrate von 10 l/min zugeführt. Die Fragmentspannung für die Proben betrug 280 V und die Verweilzeit 200 ms. Der Analyt wurde im Scanmodus32 nachgewiesen.

Die antioxidative Wirkung der erhaltenen Pektin-Oligosaccharide wurde in verschiedenen Konzentrationen im Bereich von 1,25 bis 80 mg/ml bewertet. 0,5 ml POS wurden zu 2 ml einer 0,2 mM methanolischen Lösung von 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) gegeben. Die Reaktionsgefäße wurden für 30 Minuten bei 25 °C im Dunkeln aufgestellt. Anschließend wurde die Absorption der Proben bei 517 nm untersucht. Die Kontrolle der Reaktion war 0,2 mM DPPH und 60 % Ethanol wurde als Blindwert verwendet. Basierend auf der gemessenen Absorption wurde die Radikalfängeraktivität (RSA) nach Gl. berechnet. (1)44:

Die MCF-7-Zelllinie von menschlichem Brustkrebs (erworben von der Zellbank der Universität Isfahan) wurde in COM-Medium aus Dulbeccos modifiziertem Eagle-Minimummedium (DMEM; BioIdea) mit 10 % fötalem Rinderserum (BioIdea) und 1 % Penicillin kultiviert –Streptomycin-Lösung (Sigma, USA)45.

Zur Analyse der Zelllebensfähigkeit wurde der MTT-Assay ((3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid) verwendet. Die Zellen wurden in Kulturplatten mit 96 Vertiefungen in einer Dichte von 10.000 Zellen pro Zelle ausplattiert gut inkubiert und in einem CO2-Inkubator bei 37 °C in 5 % CO2 und 95 % Luftfeuchtigkeit für 24 Stunden inkubiert. Am nächsten Tag wurden die Zellen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH 7) gewaschen und mit 5 und 40 mg/ml behandelt Konzentration von Pektin und erhielt POS für 24 und 48 Stunden. Darüber hinaus wurden zu den jeweiligen Zeitpunkten 20 μl MTT-Lösung (5 mg/ml) in die Vertiefungen gegeben und die Zellen wurden 4 Stunden lang in einem CO2-Inkubator im Dunkeln inkubiert. Das Medium wurde entfernt und die von den Zellen gebildeten Formazan-Kristalle wurden mit 100 µl Dimethylsulfoxid (DMSO) aufgelöst. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde mit einem Multimode-Lesegerät bei 570 nm gemessen und als Gleichung (2)46 berechnet:

Die Zellen wurden auf Kulturplatten mit 24 Vertiefungen in einer Dichte von 100.000 Zellen pro Vertiefung geerntet und 24 Stunden lang in einem CO2-Inkubator inkubiert. Die Zellen wurden mit PBS gewaschen und 24 und 48 Stunden lang mit Konzentrationen von 5 und 40 mg/ml des erhaltenen POS behandelt. Fortan wurde Propidiumiodid (PI, Sigma) zum Nachweis immortalisierter Zellen verwendet. Die Zellen wurden mit einem Durchflusszytometer (Becton Dickinson FACS Calibur) bewertet und die Verteilung der Zellen wurde mit der CellQuest-Software analysiert47.

L-929-Maus-Fibroblastenzellen wurden in COM-Medium kultiviert und auf Kulturplatten mit 96 Vertiefungen ausplattiert. Nach 24 Stunden wurden die Zellen 24 und 48 Stunden lang mit einer Konzentration von 5 und 40 mg/ml des erhaltenen POS behandelt. Anschließend wurde der erwähnte MTT-Assay durchgeführt, um die zytotoxischen Wirkungen der erhaltenen Verbindungen zu analysieren46.

Alle während dieser Studie analysierten Daten sind in diesem veröffentlichten Artikel und seinen ergänzenden Materialdateien enthalten.

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Referenzen herunterladen

Die Autoren danken der Universität Isfahan für die finanzielle Unterstützung, die einem MS-Studenten für einen Ausbildungszeitraum in der Abteilung für Zell- und Molekularbiologie und Mikrobiologie der Universität Isfahan gewährt wurde.

Abteilung für Zell- und Molekularbiologie und Mikrobiologie, Fakultät für Biowissenschaften und Technologie, Universität Isfahan, Isfahan, 8174673441, Iran

Behnam Ashrafian & Afrouzossadat Hosseini-Abari

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BA: Datenkuration; Formale Analyse; Untersuchung; Schreiben. AHA: Aufsicht; Methodik, Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung.

Korrespondenz mit Afrouzossadat Hosseini-Abari.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die Originalautor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Ashrafian, B., Hosseini-Abari, A. Untersuchung der Bioaktivität ungesättigter Oligo-Galacturonsäuren, die aus Apfelabfällen durch die Pektinasen Alcaligenes faecalis AGS3 und Paenibacillus polymyxa S4 hergestellt werden. Sci Rep 12, 15830 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-20011-2

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Eingegangen: 09. Juli 2022

Angenommen: 07. September 2022

Veröffentlicht: 22. September 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-20011-2

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